La criopreservación, que consiste en almacenar material biológico en nitrógeno líquido (LN, -196 grados C), ofrece una opción valiosa para la conservación a largo plazo de semillas no ortodoxas y especies propagadas vegetativamente en el sector de la agrobiodiversidad y la flora silvestre. Aunque la criobanca a gran escala de colecciones de germoplasma ha ido en aumento en todo el mundo, la amplia aplicación de protocolos de criopreservación se ve obstaculizada por la falta de protocolos universales de criopreservación, entre otros. Este estudio estableció un enfoque sistemático para desarrollar un procedimiento de criopreservación por vitrificación en gotas para los brotes de crisantemo. El procedimiento estándar incluye una precultura en dos pasos con 10% de sacarosa durante 31 h y con 17.5% de sacarosa durante 16 h, osmoprotección con una solución de carga C4-35% (17.5% de glicerol + 17.5% de sacarosa) durante 40 min, crioprotección con una solución de vitrificación alternativa A3-80% (33.3% de glicerol + 13.3% de dimetilsulfóxido + 13.3% de etilenglicol + 20.1% de sacarosa) a 0 grados C durante 60 min, y enfriamiento y recalentamiento utilizando tiras de papel de aluminio. Después de la descarga, un procedimiento de regeneración en tres pasos que comienza con un medio sin amonio con 1 mg L de ácido giberélico (GA) y 1 mg L de adenina bencílica (BA), seguido de un medio que contiene y no contiene amonio con reguladores de crecimiento, fue esencial para el desarrollo de plántulas normales a partir de brotes criopreservados. Una criobanca piloto de 154 accesiones de germoplasma de crisantemo se inició con una regeneración post-criopreservación del 74.8%. Este enfoque facilitará la criobanca del mayor germoplasma de la familia Asteraceae como un método complementario de conservación a largo plazo.